Hamilton zaczęła naukę matematyki na University of Michigan, a w 1958 roku ukończyła Earlham College. Rok później rozpoczęła pracę w Massachusetts Institute of Technology, gdzie rozwijała oprogramowanie do wykrywania wrogich samolotów. W MIT pracowała do połowy lat 70. i kierowała działem inżynierii oprogramowania.
Po otrzymaniu przez instytut kontraktu NASA na stworzenie oprogramowania pokładowego misji Apollo Hamilton stanęła na czele zespołu odpowiedzialnego za jego opracowanie i testy. Była pierwszą programistką oraz pierwszą kobietą zatrudnioną przy tym projekcie. Jej zespół zaprojektował system, który podczas lądowania Apollo 11 potrafił wykryć przeciążenie komputera i przekierować jego działanie na najważniejsze zadania.
W 1969 roku alarm komputera włączył się na krótko przed lądowaniem na Księżycu. Oprogramowanie ograniczyło zadania wykonywane w tle, dzięki czemu system mógł nadal wspierać kluczową fazę misji. Za wkład w rozwój nauki i eksplorację kosmosu Hamilton otrzymała w 2016 roku Prezydencki Medal Wolności z rąk Baracka Obamy. Pozostawiła córkę, zięcia, dwóch wnuków i czworo prawnuków.